Вопрос о создании ботанического сада был поднят ещё в 1834 году архитектором В. И. Беретти, по проекту которого возводился Киевский университет св. Владимира. Он предложил разместить сад на пустынной территории, расположенной у корпуса университета. Для этого из Кременецкого лицея в Киев были привезены 513 растений, которые временно разместили в Царском (ныне Городском) саду. Однако из-за отсутствия средств закладка сада была отложена на пять лет. Лишь в 1839 году Киевский учебный округ дал разрешение на закладку временного ботанического сада под руководством заведующего кафедрой ботаники Киевского университета Р. Э. Траутфеттера, который возглавил руководство ботаническим садом в должности директора.

Официальной датой основания Киевского ботанического сада считается 22 мая 1839 года, когда Р. Э. Траутфеттер начал делать первые посадки растений.
В 1841 году сад получает постоянный статус. По плану архитектора Лауфера сооружается оранжерейный комплекс, разбиваются террасы, которые сохранились до наших дней.